Sano, että järjestät 2X-peittoalueen. Oletetaan, että näytteessä S on yksi vertailupohja ja yksi vaihtoehtoinen emäs. On vaikea sanoa onko kyseessä sekvensointivirhe vai heterotsygootti. Oletetaan, että sinulla on 1000 muuta näytettä, kaikki 2x lukusyvyydellä. Yhdellä niistä on kaksi ALT-emästä; Kymmenellä niistä on yksi REF ja yksi ALT. Yleensä on epätodennäköistä, että kaikilla näillä näytteillä on sama sekvenssivirhe. Sitten voit väittää, että näytteellä S on het. Usean näytteen kutsuminen auttaa lisäämään ei niin harvinaisten SNP: iden herkkyyttä. Huomaa, että tässä on tärkeää olettaa virheiden riippumattomuus. Esivanhemmalla on vain pieni epäsuora vaikutus.

Usean näytteen kutsuminen rankaisee hyvin harvinaisia ​​SNP: itä, erityisesti yksittäisiä. Kun välität vain muunnelmista, tämä on hyvä. Yhden näytteen puheluiden yhdistäminen naiivisti tuottaa suuremman virhesuhteen. Usean näytteen kutsuminen auttaa myös varianttien suodatusta myöhemmässä vaiheessa. Esimerkiksi näytteelle, joka on sekvensoitu 30X: n peitteeseen, et tiedä, johtuuko sivusto 45X syvyydestä mahdollisesta CNV / väärinkartoituksesta tai tilastollisesta vaihtelusta. Kun näet 1000 30X-näytettä 45X-syvyydessä, voit helposti tietää, että katsot CNV / systemaattista väärinkartoitusta. Useat näytteet parantavat useimpia tilastollisia signaaleja.

Vanhemmat menetelmät yhdistävät kaikki BAM: t, kun kutsutaan variantteja. Tämä on tarpeen, koska yhdellä matalan peiton näytteellä ei ole tarpeeksi tietoa piilotettujen INDEL-tunnusten palauttamiseksi. Tätä strategiaa ei kuitenkaan ole niin helppo yhdistää massiivisesti; Uuden näytteen lisääminen käynnistää soiton uudelleen, mikä on myös erittäin kallista. Koska teemme enimmäkseen korkean kattavuuden sekvensointia näinä päivinä, vanhalla INDEL-puhelun ongelmalla ei ole väliä nyt. GATK: lla on tämä uusi yhden näytteen kutsuputki, jossa yhdistät näytekohtaiset gVCF: t myöhemmin. Tällainen näyteyhdistämisstrategia on ehkä ainoa järkevä ratkaisu, kun olet tekemisissä 100 000 näytteen kanssa.

Niin kutsuttu haplotyyppipohjainen varianttipuhelu on erillinen kysymys. Tämän tyyppinen lähestymistapa auttaa soittamaan INDEL: iin, mutta sillä ei ole paljon merkitystä moninäytepuheluille. Lisäksi kysymyksessäsi olevista kolmesta soittajasta vain GATK (ja Scalpel, jota et ole maininnut) käyttää kokoonpanoa yleensä. Freebayes ei. Platypus tekee, mutta vain rajoitetusti eikä toimi hyvin käytännössä.

Luulen, että haluat todella puhua imputointiin perustuvasta kutsusta. Tämä lähestymistapa parantaa edelleen herkkyyttä LD: n suhteen. Riittävillä näytteillä voit mitata LD: n kahden sijainnin välillä. Oletetaan, että kohdassa 1000 näet yhden REF-lukun eikä ALT-lukemia; kohdassa 1500 näet yhden REF-lukeman ja kaksi ALT-lukua. Et soita yhdelle SNP: lle sijainnissa 1000 edes useita näytteitä. Kuitenkin, kun tiedät, että nämä kaksi asemaa ovat tiiviisti yhteydessä toisiinsa ja hallitsevat haplotyypit ovat REF-REF ja ALT-ALT, tiedät, että tutkittavasta näytteestä todennäköisesti puuttuu ALT-alleeli. LD siirtää signaaleja sivustojen yli ja parantaa voimaa tehdä oikeita genotyyppipuheluja. Kuitenkin, koska teemme nykyään enimmäkseen suuren peittävyyden sekvensointia, imputointipohjaisilla menetelmillä on vain vähäinen vaikutus ja niitä käytetään harvoin.

Etu lisänäytteistä näkyy kohdassa 1. Todennäköisyys, että soitat muunnoksen, on (1) tiettyä muunnosta tukevan peittävyyden syvyys (sivuuttamatta kartoitusta / perustason laatua) ja (2) todennäköisyys, että muunnos on olemassa oleva taustatieto. Pienellä syvyydellä ja ilman taustatietoa huonosti peitettyjen varianttien oletetaan olevan sekvenssivirheitä. Lisää näytteitä voi vain auttaa lisäämään taustatietoa sijainnista.